如何在顯微鏡中計算和調整物空間像素大小

在顯微鏡成像中，影像品質對於精確分析和觀察至關重要。無論是研究生物標本、材料，或是進行醫學研究，取得清晰、高品質的影像都是不可或缺的。決定顯微鏡影像品質的關鍵因素之一是偵測器的像素尺寸。像素尺寸對光線收集起著至關重要的作用，直接影響影像的解析度、靈敏度和清晰度。

顯微鏡中的物空間像素尺寸是？

物空間像素尺寸指的是物空間（即顯微鏡成像的空間）中每個像素的物理尺寸。它本質上定義了影像中每個像素代表的實際樣本的比例。簡單來說，較小的物空間像素尺寸可以捕捉到樣本的更多細節，而較大的像素尺寸則會導致影像粗糙，細節減少。

物空間像素尺寸的重要性在於它能夠直接影響顯微影像的解析度和品質。高解析度影像對於精確測量和詳細分析至關重要，而高解析度影像依賴較小的物空間像素尺寸。另一方面，較大的像素尺寸可能會降低影像質量，尤其是在處理細胞、組織或奈米顆粒等精細結構時。

圖 1：顯微鏡光路與物空間像素尺寸定義

物空間像素尺寸是指影像中單一相機像素所涵蓋的原始成像物件的寬度或高度。對於顯微鏡而言，這由系統總放大倍率決定。

如何計算物體空間像素大小

物體空間像素大小由下式給出：

總放大倍率是透過將光路中所有光學元件的放大倍率相乘得到的。

顯微鏡系統的主要放大倍率來自物鏡，例如 10 倍、20 倍或 60 倍物鏡。有時，光路中可能存在其他放大鏡片，例如顯微鏡鏡身內部或相機支架內部。檢查額外的放大倍率非常重要，因為相機支架中的鏡片可能並不總是顯而易見的，需要拆卸並檢查支架才能發現。

測量放大倍率

無論如何，準確測量光學系統的總放大倍率是明智之舉。方法是拍攝一張標尺、精密尺或其他已知尺寸物體的影像，然後在相機規格表中尋找相機像素尺寸。顯微鏡物鏡和其他鏡頭的放大倍率可能與其標稱值有幾個百分點的偏差。

筆記：顯微鏡目鏡通常增加的 10 倍放大倍率不包含在相機的物空間像素尺寸計算中。

影響物體空間像素大小的因素

顯微鏡中物空間像素大小受多種因素影響。這些因素包括：

●物鏡放大倍率：物鏡放大倍率越高，物空間像素尺寸越小。然而，提高放大倍率也需要更高品質的光學元件，以避免影像模糊或失真。

●感測器解析度和像素尺寸：相機感光元件的解析度和像素尺寸起著至關重要的作用。像素尺寸較小的感光元件會產生較小的物空間像素尺寸，從而獲得更高解析度的影像。

●光學系統設定：光學裝置，包括目鏡或分光鏡等任何中間光學元件，都會影響總放大倍率，進而影響物空間像素尺寸。

●相機感光元件類型（CMOS 與 CCD）：所使用的相機感光元件類型也會影響像素尺寸。例如，CMOS感測器因其高效性和低噪聲，常用於科學應用領域。

在設計顯微鏡系統時，必須仔細考慮這些因素，以針對特定應用最佳化影像品質。

如何測量物體空間像素大小以及如何更改它

圖2：不同鏡頭焦距下的視角

鏡頭焦距決定了相機感光元件的視角（AOV）以及每個像素的視角。

具體數值取決於感光元件尺寸和相機像素尺寸。此處所示範例適用於標準的 4MP 相機。sCMOS相機採用 13.3mm x 13.3mm 方形感光元件，像素尺寸為 6.5 μm x 6.5 μm。

對於基於透鏡的系統而言，物空間像素尺寸的概念比顯微鏡更複雜。

顯微鏡具有固定的平面焦平面，在整個視野範圍內始終垂直於光軸或平行於相機。重要的是，顯微鏡物鏡的光學結構通常是「遠心」的，這意味著靠近物鏡的物體看起來不會更大，就像沒有透視效果一樣。因此，整個視野範圍內的物空間像素大小是相同的。

然而，在絕大多數基於鏡頭的系統中，我們確實需要考慮透視效應。由於基於鏡頭的系統通常具有較大的景深（物體清晰成像的距離範圍），因此精確定義物空間像素尺寸可能具有挑戰性，並且在影像的不同區域可能有所不同。

此外，理論計算物空間像素尺寸需要知道感光元件到鏡頭的距離和鏡頭的焦距。鑑於許多鏡頭的焦距可以在設定的範圍內平滑變化（通常稱為“變焦”鏡頭），因此精確確定焦距可能具有挑戰性。

使用每個像素的角度視野角

對於基於鏡頭的系統而言，更簡單且更通用的方法是使用每個像素的視角（x 和 y 方向）。此視角與物空間像素尺寸在光線收集能力和空間採樣方面具有非常相似的縮放關係，但不受成像物件到相機距離的影響。對於定焦鏡頭（也稱為“主鏡頭”），對於給定的相機像素尺寸，每個像素的視角是固定的。對於焦距可調的變焦鏡頭，x 或 y 方向的視角取決於焦距。在這兩種情況下，每個像素的視角（以角秒為單位）都可以用以下公式近似表示：