15/06/2022Catturare la luce fuori fuoco rappresenta una sfida per ottenere immagini nitide e ad alto contrasto in molte applicazioni di imaging. La microscopia digitale a scansione di luce (DSLM) offre un metodo efficace per ridurre la cattura di luce fuori fuoco sincronizzando l'illuminazione con l'otturatore a scorrimento (rolling shutter) delle moderne fotocamere CMOS. Tuttavia, questa precisa sincronizzazione richiede il controllo completo del funzionamento dell'otturatore a scorrimento della fotocamera, una funzionalità offerta dalle fotocamere Tucsen con la modalità di controllo dell'otturatore a scorrimento.
Che cos'è una serranda avvolgibile?
L'otturatore è la parte della fotocamera che avvia e interrompe l'esposizione alla luce. In passato, le fotocamere scientifiche utilizzavano otturatori meccanici, che si aprivano per esporre l'immagine e si chiudevano per terminare l'esposizione. Gli otturatori meccanici erano lenti e soggetti a problemi di affidabilità con un uso prolungato. Oggi, le fotocamere scientifiche utilizzano otturatori elettronici, che sono notevolmente più veloci, semplici e versatili.
Le fotocamere a otturatore scorrevole iniziano l'acquisizione dalla parte superiore del sensore e "scorrono" riga per riga fino alla parte inferiore. Questa acquisizione prevede tre processi: ripristino del segnale, esposizione alla luce e lettura.
L'esposizione di ciascuna riga inizia azzerando il segnale acquisito di ogni pixel. Trascorso il tempo di esposizione prestabilito per la riga superiore, la lettura, che segna la fine dell'acquisizione, scorre verso il basso allo stesso modo. Questo lascia un'area di pixel attivi che si estende dall'alto verso il basso della telecamera, la cui altezza è determinata dalla durata del tempo di esposizione. Con la telecamera in funzione alla massima velocità, il ritardo per riga è in genere compreso tra 5 e 25 microsecondi per riga di pixel, a seconda della velocità della telecamera.
Per sfruttare le tecniche ottiche che richiedono la sincronizzazione tra la scansione dell'illuminazione e l'otturatore a scorrimento della fotocamera, in genere questo ritardo è troppo breve, il che significa che l'otturatore a scorrimento funziona troppo velocemente perché gli altri componenti hardware riescano a stargli dietro. È qui che entra in gioco la modalità di controllo dell'otturatore a scorrimento.
Figura 1: Schema di funzionamento di una serranda avvolgibile
Come funziona la modalità di controllo dell'otturatore a scorrimento
Grazie all'intelligenza integrata nelle telecamere Tucsen, il funzionamento dell'otturatore rolling shutter può essere regolato con precisione per sincronizzarsi con hardware esterno. Aggiungendo un piccolo ritardo tra il reset e la lettura di ogni riga, è possibile controllare il tempo necessario affinché l'area di pixel attiva si sposti sul sensore, consentendo così questa sincronizzazione.
Inoltre, l'altezza della fessura dell'area attiva scansionata può essere regolata con precisione. Tempi di esposizione più lunghi o ritardi di linea più brevi comportano un'altezza della fessura maggiore. Nel caso del DSLM, questo può essere utilizzato per focalizzare l'attenzione solo sull'area illuminata del campione, trovando un equilibrio tra l'esposizione dei pixel per il tempo massimo possibile al fine di acquisire efficacemente il segnale e la minimizzazione della luce fuori fuoco.
Figura2A sinistra: schema del funzionamento dell'otturatore a scorrimento alla massima velocità della fotocamera. A destra: schema che mostra la velocità dell'otturatore a scorrimento con la modalità di controllo dell'otturatore a scorrimento che aggiunge un ritardo aggiuntivo tra ogni riga per consentire la sincronizzazione con altri componenti hardware.
Con questo ritardo opzionale, ora ci sono tre variabili importanti da comprendere che determinano il funzionamento del rolling shutter, indicando l'altezza dell'area dei pixel "attivi" e la velocità con cui attraversa il sensore.
Tempo di linea: Questo è il tempo predefinito impiegato dal sensore per leggere una riga e passare alla successiva. Determina la "velocità" nativa del sensore della fotocamera e può essere specificato nel software della fotocamera oppure approssimato per una determinata regione di interesse (ROI) e modalità della fotocamera tramite:
Dove "Frequenza massima dei fotogrammi della fotocamera" si riferisce alla frequenza dei fotogrammi quando non è limitata né dalla durata del tempo di esposizione né dalla frequenza di attivazione esterna.
Tempo di esposizione:Questo determina per quanto tempo ogni riga di pixel rimane attiva, determinando così l'altezza dell'area attiva per un dato tempo di riga e tempo di ritardo.
Ritardo di linea:Ecco quanto ritardo aggiuntivo viene aggiunto dalla modalità di controllo dell'otturatore scorrevole. La modalità di controllo dell'otturatore scorrevole consente di aggiungere un ritardoin multipli interi del tempo di linea. Ad esempio, se il tempo di riga per una telecamera è di 10 microsecondi, ritardo aggiuntivo per riga di 1, 2,…È possibile aggiungere fino a 8.928, indicando il numero di multipli di 10 microsecondi.
Altrettanto importante è l'altezza della regione di interesse (ROI) utilizzata, poiché questa determinerà il numero di linee che l'area attiva dovrà scorrere prima di resettarsi.
Modalità di controllo dell'otturatore scorrevole Modalità di sincronizzazione
Esistono due modalità operative per il controllo dell'otturatore a rullo, a seconda della variabile che si ritiene più importante controllare.
In Modalità di ritardo tempo di lineaÈ possibile impostare il tempo di ritardo come specificato sopra. Il software può quindi indicare, per il tempo di esposizione specificato, quale sarà l'altezza della fenditura risultante, ovvero l'altezza dei pixel attivi nell'otturatore a scorrimento.
In Altezza pixel attivo/fessuraIn questa modalità, è possibile impostare il numero di righe del sensore che si desidera siano attive durante lo sweep dell'otturatore a scorrimento. Il tempo di esposizione specificato verrà quindi utilizzato per calcolare il ritardo di riga necessario per ottenere automaticamente questa altezza di fessura.
Impostazione della modalità di controllo dell'otturatore scorrevole nel software
Comandi della modalità operativa (stato)
Figura 3: Esempio di interfaccia per il controllo della modalità di controllo dell'otturatore scorrevole dal software Tucsen Mosaic. Tutte le opzioni disponibile tramite Micro-Manager e SDK.
Sono disponibili tre stati (modalità operative):Off, Ritardo di linea, Altezza della fessura.
• Quando impostato suSpento, il sensore si comporta normalmente senza alcun ritardo aggiuntivo.
• Quando impostato suRitardo di lineaIn questa modalità, è possibile specificare il ritardo di linea in unità di tempo di linea, come spiegato sopra.
Figura 4: Opzioni software per il ritardo di linea. EsempioInterfaccia del software Tucsen Mosaic. Tutte le opzioni sono disponibili tramite Micro-Manager e SDK.
Il numero di cicli di tempo di linea che possono essere aggiunti al ritardo configurabile varia da telecamera a telecamera. Il nuovo tempo di linea della telecamera, dopo l'aggiunta del ritardo, è quindi:
Tempo di intervallo di linea = tempo di linea(sensore)+(Tempo di linea)(sensore)× Ritardo di linea)
Il valore del parametro diVelocità di rotolamentoè uguale aTempo di intervallo di linea.
Il tempo totale di lettura dell'immagine è quindi:
Rtestafuori Tempo(immagine)= Tempo di intervallo di linea×Nfile.
Nfilerappresenta il numero totale di righe di pixel di acquisizione nella regione di interesse. La frequenza dei fotogrammi durante l'acquisizione in questa modalità dipende dal numero di linee da acquisire e dal tempo di ciclo di ciascuna linea:
Frequenza dei fotogrammi = 1/(Tempo di lettura)(immagine)+ Tempo di esposizione)
•Quando impostato suAltezza della fessura mode, puoi impostare ildimensione dell'area attiva scansionata, indicata con tIl numero di righe di pixel tra il segnale di "reset" e il segnale di "lettura".L'altezza della fessura (Slit Height) varia da 1 a 2048 pixel. Per convertire questo valore in una dimensione fisica, moltiplicarlo per la dimensione in pixel indicata nella scheda tecnica della fotocamera.
Figura 5: Opzioni di controllo della modalità Altezza fessura. EsempioInterfaccia del software Tucsen Mosaic. Tutte le opzioni sono disponibili tramite Micro-Manager e SDK.
Il software calcolerà automaticamente il ritardo di linea e l'intervallo di linea necessari, secondo la seguente formula:
Ritardo di linea = Tempo di esposizione(Linee)Altezza della fessura(Linee)
In modalità Alta Velocità (modalità di guadagno della telecamera), l'intervallo di Altezza Fessura può essere impostato solo su un numero pari, poiché in tale modalità le linee vengono lette a due a due. I parametri in modalità Alta Velocità vengono calcolati come segue.
Ritardo di linea = Tempo di esposizione(Linee)/ ½ Altezza della fessura(Linee)
Altezza della fessura = (Tempo di esposizione(Linee)÷ Ritardo di linea)×2
Comandi di direzione della scansione
Esistono tre opzioni per la direzione di apertura della serranda avvolgibile:
DProprioLa direzione di scansione verso il basso è la direzione di scansione predefinita per le telecamere sCMOS. L'otturatore rolling shutter inizia dalla prima riga nella parte superiore del sensore e scansiona fino all'ultima riga in basso. Ogni acquisizione di fotogramma successiva inizia dalla prima riga in alto.
Figura 6: Schema della modalità di scansione verso il basso
Up:Nella modalità di scansione verso l'alto, l'otturatore a scorrimento inizia dalla riga inferiore e scansiona fino alla riga superiore della prima riga. Ogni acquisizione di fotogramma successiva inizia dalla riga inferiore. Sebbene l'ordine di acquisizione dei dati sulla fotocamera sia ora invertito, l'immagine risultante inviata al software mostrerà comunque l'orientamento originale, ovvero l'immagine non sarà capovolta verticalmente rispetto alla modalità di scansione verso il basso.
Figura 7: Schema della modalità di scansione verso l'alto
Ciclo giù-suQuando si esegue la scansione alternativamente dall'alto verso il basso, l'otturatore a rullo parte dalla prima riga in alto e scende fino all'ultima riga in basso. Per il fotogramma successivo, l'otturatore a rullo parte dalla riga inferiore e scansiona verso l'alto fino alla riga superiore, e così via. L'orientamento dell'immagine acquisita in questa modalità è lo stesso dell'orientamento della scansione verso il basso.
Figura 8: Schema della modalità di scansione del ciclo giù-su
• ReaRipristino della direzione del dubbio
Questa funzione è disponibile solo nella modalità Ciclo Giù-Su.
L'impostazione predefinita per questo parametro è "Sì", il che garantisce che il primo fotogramma di ogni nuova sequenza di acquisizione inizi dalla riga più in alto e proceda verso il basso.
Quando questo parametro è impostato su "No", il primo fotogramma di ogni nuova acquisizione inizierà nella posizione dell'ultimo fotogramma della sequenza precedente. Se l'ultimo fotogramma termina sulla riga inferiore, il primo fotogramma delle acquisizioni successive inizierà sulla riga inferiore e si propagherà verso l'alto.
